Extraccion y cuantificacion de scarasa

Extraccion y cuantificacion de scarasa gytareascrik HOR6pR 16, 2011 | 7 pagcs Extracción y cuantificación de la enzima sacarasa. Introducción. La invertasa o sacarasa (P-D-fructofuranosidasa, p-D- fructofuranósido fructohidrolasa, cataliza la hidrólisis de restos terminales no reductores P-Dfructofuranosidicos de fructofuranósidos. Entre los sustratos sobre los que actúa el más significado es, sin duda, la sacarosa, de ahí que el enzima se designe con el nombre de sacarasa.

La denominación trivial de invertasa, con la que también se conoce, hace referencia al echo de que los productos de la reacción son conocidos desde antiguo como «azúcar invertido» ya que mientras la sacarosa es dextrorrotatoria, la mezcla equimolecular de glucosa y fructosa que resulta de su hidrólisis es levarrotatoria por lo que en el proceso se origina u valor de rotación ópti sacarosa *650) fructosa ([alD— -920) ora to View nut*ge sitivo a negativo) del +370) + D- La invertasa es un enzima ampliamente distribuido, estando presente tanto en microorganismos como en animales y vegetales, jugando un papel limportante en el catabolismo de fructanos y más específicamente en el de la sacarosa, en especial n aquellos organismos en los que dichos azúcares son utilizados como fuente de carbono y energía. El estudio de la actividad invertasa presenta un gran interés tanto desde un punto de vista académico como de inv Swipe to vlew next page investigación aplicada, siendo uno de las enzimas más conocidas. A modo de ejemplo podemos referir que la invertasa fue el primer enzima cuya cinética se estudió en profundidad (estudios clásicos de Michaelis-Menten) y que fue utilizado industrialmente.

Para la determinación de la actividad invertasa se utilizará un ensayo indirecto en el que los productos de reaccion serán etectados espectrofotométricamente tras su conversión en derivados coloreados. En concreto, la extensión de la hidrólisis enzimática de sacarosa (azúcar no reductor) en glucosa más fructosa (azúcares reductores) se valorará mediante uno de los diversos métodos existentes para la estimación de azúcares reductores. Nos referimos exactamente al método del ácido 3,5- dinitrosallcílico (DNS), el cual se basa en la reducclón del DNS (de color amarillo) por la glucosa u otro azúcar reductor al ácido 3- amino-5 nitrosalic(lico (de color rojo ladrillo) (Chaplin, 1986), cuya resencia puede detectarse por lectura de la Absorbancia en la zona de 540-570 nm. Objetivos.

Observar y establecer condiciones optimas para la enzima así como pH, temperatura, concentración de sustrato, concentración de enzima, IJ. R. Materiales y reactivos. 10 tubos de ensaye. 1 vaso de preciptado de 200ml. 1 vaso de precipitado de 100ml. 1 vaso de preciptado de 20ml. 2 pipetas volumétricas de 5ml, 10ml. 1 pipeta graduada de 5ml. Goteros. Matraces de aforo de 50ml. Pinzas. Agitador. Espátula. Gradilla. graduada de Sml. Termómetro. Micro pipeta. Frascos contenedores de liquidos. Equipos. Balanza analítica. Centrifuga. Potenciómetro. Espectrofotómetro. Plancha eléctrica. Refrigerador. Reactivos. Levadura de panadería. Agua destilada. Reactivo de Benedict.

Tampones de fosfatos: pH=3, 5, 6 y 8. Tampón de acetato o. 1M, PH=5, en Naci O. 5M. NaOH. Naci. Procedimiento: 1 Obtención del extracto crudo de sacarasa de la levadura de panadería. Suspender Igr de preparado lofilizado de levadura en 200ml de tampón de extracción (tampón acetato 0. 1 M, pH S en NaCl 0. 5M). Agitar la mezcla durante 15min (puede ayudarse la extracción mediante sonificación de la misma), centrifugar vto homogeneización de 31_1f,• adante como extracto 2ml 1 2ml 1 2ml I Sustrato. 2ml 2ml 2ml 2ml I Buffer 1 2ml 1 2ml 1 2ml 1 2ml I Colocar los 4 tubos de ensaye preparados con sus respectivas sustancias en una plancha y llevar a temperatura ebullición.

Observar el cambio de coloración de las muestras en cada tubo con diferente pH, el cambio debe ser un color rojo ladrillo. PH óptimo: 5. Temperatura óptima: 650C. Variación de concentración de enzima. En pH óptimo=5. Enzima invertasa. 1 ml 1. 5ml 2ml 2. 5ml 1 3ml Sustrato. 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml I Incubar tubos a 370C durante 15min_ Preparación de blanco y Standard para lecturas de espectroscopia. Blanco: Agregar 2ml de reactivo + 2microlitros de H20. Incubar 15 min 37cc. Standard: 2microlitros de Standard. Incubar 15min a 370C. Realizar lecturas en espectrofotómetro. Realizar lecturas en espectrofotómetro: A 340nm de longitud de onda, primero se calibra a 100 con blanco, después se pone el Standard y tomar su lectura.

Para las muestras primero meter blanco calibrar a 100, después meter la cubeta con muestra 1 y tomar lectura, se aplica esto para las 5 muestras preparadas. Variación de la concentración de sustrato. Dependiendo de la mayor absorbancia reportada en la variación de concentración de enzima se toma esa para agregara los tubos de ensayo. Enzima invertasa. 1 1. 5rnI 1 1. 5rnl 1 1. 5ml 1 1. 5ml 1 1. 5rnl I Sustrato. lml 1. 5ml 3ml 1. 5ml I Sustrato. lml 1. 5ml 2ml 2. 5mI 3ml Realizar lecturas en espectrofotómetro: prmero se calibra a 100 con blanco, después se pone el Standard y tomar su lectura. para las muestras primero meter blanco calibrar a 100, después para las S muestras preparadas.

Cálculos para preparación de soluciones buffer de fosfato. pH=3 Base: NaH2P04=H2P04- +Na+ Ácido: H3P04= H2P04- +H+ Fracción molar. [Ácido]-1/1+7. 2444-O. 1212 -3gr 86=0. 0043mI PH=s Ácido: H3P04= H2P04- pH-Pka+log[gase/Ácido] . 99 Fraccion molar. .99/1+1. 99=0. 6655 +1. 99=0. 3344 637gr ,11. 71 lml pH-6 Base: NaH2P04 pH=8 Ácido: H3P04= H2P04- 41-4* Fracción molar +6. 3095=0. 8632 +6. 3095-0. 1368 Preparación de solución acetato 0. 1M, pH5 en NaCl 0. 5M. pH=5 pH=pka+log[3ase/Ácido] 97 . 8197/1+1. 8197-3. 6394 n +1. 8197=0. 3546 enzimática a partir de la cuantificación de glucosa. standard=o. 2284 Abs. mx+b 0. 2284=0. 0285x+0. 0073 X- 7. 7579ml.

Cinética enzimática de la activación de sacarasa. Cálculos para Vmax y Km /v-km/Vmax. 1 ‘(s) +1 [Vmax 1 IVmax=0. 7 110. 07=vmax-14. 2857 grimi Km/Vmax=0. 06 Km=O. 8571 gr/ml Discusión. El estudio de la actividad invertasa presenta un gran interés tanto desde un punto de vista académico como de investigación aplicada, siendo uno de las enzimas más conocidas. Conclusión. Las diferentes funciones que desempeña la enzima sacarasa dentro de los organismos vivientes son controladas por reacciones metabólicas específicamente en el entorno en el que se puede manifestar. La concentración de esta vital importancia que se mantengan en los niveles a que pueda realizar sus